VISSZA  A SZAKIRODALOMHOZ

A CoD™ tea fogyasztása csökkentette a 7,12-Dimetilbenz[a]antracén (DMBA) indukálta onko/szuppresszor gének expressziójának emelkedését, krónikus állatkísérletben

Budán Ferenc1, Dávid Tamás2,

Bencsik Tímea3, Finta Hajnal4, Varjas Tímea1, Ember István1

1 PTE AOK Orvosi Népegészségtani Intézet, Pécs, Magyarország

2 Nemzetközi CoD™ Rák Információs Központ Közalapítvány, Lébény, Magyarország

3 PTE AOK Farmakognoziai Intézet, Pécs, Magyarország

4 MOGYE, Közegészségtan Tanszék, Marosvásárhely, Románia

 

 

Korábban tesztrendszert dolgoztunk ki a potenciális kemopreventív szerek hatékonyságának kimutatására, ellenőrzésére; a kísérleti állatokat kémiai karcinogénnel (DMBA) kezeltük, ennek hatására az onko/szuppresszor- gén expressziók jelentős mértékben emelkedtek. A karcinogén indukcióval párhuzamosan (v. előtt) a vizsgált anyagot is megkapják az állatok, majd exponált kontroll csoporttal összehasonlítva kiértékeljük a feltételezett védő hatást.

Egy csoportban 6 hím és 6 nőstény CBA/Ca(H-2K) egeret (Varga Cs és mtsai. Cancer Letters, 60 (1991) 199-203, Varga Cs és mtsai. Magyar Onkológia, 46 (1992) 151-156) tanulmányoztunk, két csoport csapvizet fogysztott (kontroll), két csoport CoD™ teát fogyasztott (és kombinációban egy-egy csoport 20 mg/ttkg ip. DMBA-t kapott.) A kísérleti állatok májából, lépéből, veséjéből, tüdejéből, tímuszából, nyirokcsomóiból és csontvelejéből vett mintákból a c-myc, Ha-ras, p53, BCL2, K-ras izoláltunk Trizol protokoll szerint, β-aktin próbákkal hibridizáltuk, majd röntgenfilmen előhívtuk.

A prekancerózus állapotok és karcinogenezis modellezésére használt pluripotens és komplett karcinogén DMBA korai iniciátor és promoter: a májban, tüdőben onko/szuppresszor gén overexpressziót okoz, mindkét nem esetén. A DMBA karcinogenitást leírták tüdőben is, eredményeinknek megfelelően. Hím állatokban a CoD™  tea fogyasztás tüdőben kivédte a karcinogén hatást jelző molekuláris epidemiológiai onko/szuppresszor gén expresszió emelkedést a kísérlet teljes ideje alatt.

Az irodalom szerint a nyirokcsomók és a csontvelő limfo/leukemogén transzformációjáért és (a prekancerózus állapotokért is) a protoonkogének aktivációs mutációja és overexpressziója a felelős első sorban (a tumorszuppresszorok kiesése helyett) amit eredményeink is megerősítenek. Ezen felül a hím állatok nyirokcsomóiban és csontvelejében egyaránt jelentősen csökkentette a DMBA expozíció által indukált onkogén overexpressziót a CoD™ tea fogyasztása, míg nőstényekben nem, vagy csak mérsékeltebb módon fejtett ki hatást. (Ezen hatás a túlélési idők vizsgálatában is megnyilvánult, párhuzamos kísérletünkben.)

Korábban tesztrendszert dolgoztunk ki a potenciális kemopreventív szerek hatékonyságának kimutatására, ellenőrzésére; a kísérleti állatokat kémiai karcinogénnel (DMBA) kezeltük, ennek hatására az onko/szuppresszor- gén expressziók jelentős mértékben emelkedtek. A karcinogén indukcióval párhuzamosan (v. előtt) a vizsgált anyagot is megkapják az állatok, majd exponált kontroll csoporttal összehasonlítva kiértékeljük a feltételezett védő hatást.

Egy csoportban 6 hím és 6 nőstény CBA/Ca(H-2K) egeret (Varga Cs és mtsai. Cancer Letters, 60 (1991) 199-203, Varga Cs és mtsai. Magyar Onkológia, 46 (1992) 151-156) tanulmányoztunk, két csoport csapvizet fogyasztott (kontroll), két csoport CoD™ teát fogyasztott (és kombinációban egy-egy csoport 20 mg/ttkg ip. DMBA-t kapott.) A kísérleti állatok májából, lépéből, veséjéből, tüdejéből, tímuszából, nyirokcsomóiból és csontvelejéből vett mintákból a c-myc, Ha-ras, p53, BCL2, K-ras izoláltunk Trizol protokoll szerint, β-aktin próbákkal hibridizáltuk, majd röntgenfilmen előhívtuk.

A prekancerózus állapotok és karcinogenezis modellezésére használt pluripotens és komplett karcinogén DMBA korai iniciátor és promoter: a májban, tüdőben onko/szuppresszor gén overexpressziót okoz, mindkét nem esetén. A DMBA karcinogenitást leírták tüdőben is, eredményeinknek megfelelően. Hím állatokban a CoD™  tea fogyasztás tüdőben kivédte a karcinogén hatást jelző molekuláris epidemiológiai onko/szuppresszor gén expresszió emelkedést a kísérlet teljes ideje alatt.

Az irodalom szerint a nyirokcsomók és a csontvelő limfo/leukemogén transzformációjáért és (a prekancerózus állapotokért is) a protoonkogének aktivációs mutációja és overexpressziója a felelős első sorban (a tumorszuppresszorok kiesése helyett) amit eredményeink is megerősítenek. Ezen felül a hím állatok nyirokcsomóiban és csontvelejében egyaránt jelentősen csökkentette a DMBA expozíció által indukált onkogén overexpressziót a CoD™ tea fogyasztása, míg nőstényekben nem, vagy csak mérsékeltebb módon fejtett ki hatást. (Ezen hatás a túlélési idők vizsgálatában is megnyilvánult, párhuzamos kísérletünkben.)

 

 

Előző munkáink során molekuláris epidemiológiai kulcsgének expresszióinak mérésén keresztül tesztrendszert dolgoztunk ki a potenciálisan kemopreventív hatású anyagok hatékonyságának kimutatására, ellenőrzésére [1]. A prekancerózus állapotok és karcinogenezis modellezésére használt pluripotens és komplett karcinogén DMBA korai iniciátor és promoter: a májban és a tüdőben is a c-myc, Ha-ras, BCL2, K-ras protoonko- és konzekvensen [2] a p53  tumorszuppresszor- gén overexpresszióját okozza [3], mindkét nem esetén, különböző állatkísérletekben használt fajokon is. A c-myc gén amplifikációja és overexpressziója iniciátor szerepű az emberi és az egér melldaganatok kialakításában [4] miként a többi vizsgált protoonkogén mutációs aktivációját onkogéné és ezzel egy időben overexpresszióját is kimutatták daganatokban [5]. Ezen felül a Bcl2 gén antiapoptotikus is, overexpressziója a daganatos sejtek immortalizálódását okozza [6]. A K-ras overexpressziójának és mutáció útján történő aktiválódásának szerepe a tumoros átalakulás során az iniciáció és a progresszió mellett az áttét képzésében is klinikailag bizonyított [7].

A CoD™ tea (D/Eu reg. numb.: PZN Deutschland: 4226037)  1995-ben került forgalomba, Európa több országában kapható, étrendkiegészítőként regisztrált, potenciális daganatmegelőző hatással rendelkező teakeverék [8]. Fő hatóanyagai a macskakarom (Uncaria sp. U. tomentosa) és az argentin lángfa (Tabebuia sp. T. avellanedae) gyógynövényből származó 17 különböző alkaloid, többek közt kinonsav-glikozidok, tanninok, flavonoidok [8]. Az Uncaria tomentosa legtöbbet vizsgált aktív komponensei a pentaciklikus oxindol alkaloidok, melyek in vitro serkentik az endotelsejtekben a limfocita-proliferációs-szabályozó faktor termelését [9,10].

Az irodalom szerint az argentin lángfa hatékony lehet a rák, a leukémia, daganatos megbetegedések kezelésére [11]. Az argentin lángfa kérge gazdag a lapachol-ban (2-7%), ezenfelül lapachone-t és xyloidone-t is tartalmaz, melyeknek daganatellenes, citotoxikus hatásáról is beszámolt a szakirodalom [12].

A már korábban sikerrel alkalmazott modellünk (CBA/Ca(H-2K) egérben) [13,14] szerint a karcinogén indukcióval párhuzamosan (vagy előkezelésben is alkalmazva) megkapják az állatok a vizsgált anyagot is, jelen kísérletünkben a CoD™ teát, majd karcinogén exponált kontroll csoporttal összehasonlítva kiértékeljük a feltételezett védő hatást. Ezen molekuláris epidemiológiai kulcsgének expressziói állatkísérletekben [15] és humán mintákban is [16] jól reprezentálták a sejt szinten végbemenő tumorbiológiai folyamatokat.

 

Anyag és módszer

 

Egy csoportban 6 hím és 6 nőstény 20+/-4 g súlyú, 6-8 hetes CBA/Ca(H-2K) egeret tanulmányoztunk. Két csoport csapvizet fogysztott (kontroll), két csoport CoD™ teát fogyasztott és kombinációban egy-egy csoport 20 mg/ttkg ip. DMBA (Sigma Aldrich Budapest, Hungary) -t kapott (0,4 mg DMBA/ 0,1 ml kukoricaolajban (Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Debrecen, Hungary) oldva) egyszer a kísérlet kezdetén, és még egyszer a 2. hónap elején. A kezelés után 1 héttel, 1, 3, 6 és 12 hónappal a kísérleti állatok májából, lépéből, veséjéből, tüdejéből, tímuszából, nyirokcsomóiból és csontvelejéből mintákat vettünk.

A csoportonként pool-ozott, szervenként gyűjtött 100 mg szövetmintából TRIZOL reagens (Sigma-Aldrich, Budapest) használatával teljes RNS-t izoláltunk. A RNS tisztaságát és koncentrációját abszorpciós fotometriával ellenőriztük 260/280 nm-en. 10 μg RNS-t HYBOND N+ membránra blottoltuk, majd kemilumineszcens jelölésű (ECL kit, Amersham, Little Chalfont, England) c-myc, Ha-ras, BCL2, K-ras és p53 (Prof. Dr. Szeberényi József, Pécsi Tudományegyetem, Orvosi Biológiai Intézet) génspecifikus próbákkal hibridizáltuk. A laboratóriumi folyamatok minden lépését a felhasznált termékekhez a gyártó cégek által mellékelt előírásoknak megfelelően végeztük. A jelölés detektálása röntgen filmen történt. A kiértékelést Quantiscan software-el végeztük (Biosoft, Cambridge, UK). A kezelt és kontroll csoportok közti c-myc, Ha-ras BCL2, K-ras és p53 génexpresszió eltéréseket β-aktin expresszió arányában ábrázoltuk.

CoD tea készítés, alkalmazás: per os: 0,167 g/ttkg - humán ekvivalens dózis - 60 kg-os átlag-testtömeggel számolva (0,0033g / 3 ml csapvíz / egér) A CoD™ teát a gyártó utasítása szerint készítettük.

 


Hím CBA/Ca egerek májának génexpressziós profilja
 


Nőstény CBA/Ca egerek májának génexpressziós profilja
 


Hím CBA/Ca egerek hasi nyirokcsomóinak génexpressziós profilja
 


Nőstény CBA/Ca egerek hasi nyirokcsomóinak génexpressziós profilja



Hím CBA/Ca egerek tüdejének génexpressziós profilja



Nőstény CBA/Ca egerek tüdejének génexpressziós profilja



Hím CBA/Ca egerek csontvelőjének génexpressziós profilja
 



Nőstény CBA/Ca egerek csontvelőjének génexpressziós profilja

 

Eredmények és következtetések

 

A kísérleti állatokat kémiai karcinogénnel (DMBA) kezeltük. Ennek hatására az onko/szuppresszor- gén expressziók jelentős mértékben emelkedtek, az irodalmi adatok szerint feltételezettnek megfelelően.

A prekancerózus állapotok és karcinogenezis modellezésére használt pluripotens és komplett karcinogén DMBA korai iniciátor és promoter: a májban, tüdőben onko/szuppresszor gén overexpressziót okozott, mindkét nem esetén.

A DMBA karcinogén hatását leírták tüdőben is [17], amit eredményeink is alátámasztottak. Hím állatokban a CoD™  tea fogyasztás tüdőben kivédte a karcinogén hatást jelző molekuláris epidemiológiai onko/szuppresszor gén expresszió emelkedést a kísérlet teljes ideje alatt.

Az irodalom szerint a nyirokcsomók és a csontvelő limfo/leukemogén transzformációjáért és (a prekancerózus állapotokért is) a protoonkogének aktivációs mutációja és overexpressziója a felelős első sorban (a tumorszuppresszorok kiesése helyett) amit eredményeink szintén megerősítenek [18]. Ezen felül a hím állatok nyirokcsomóiban és csontvelejében egyaránt jelentősen csökkentette a DMBA expozíció által indukált onkogén overexpressziót a CoD™ tea fogyasztása, míg nőstényekben nem, vagy csak mérsékeltebb módon fejtett ki hatást.

Általánosságban véve megállapíthatjuk hogy a CoD™ tea fogyasztása csökkentette, vagy bizonyos esetkeben nem befolyásolta a DMBA kezelés által okozott onko/szuppresszor- gén overexpressziót, így ezen molekuláris epidemiológiai kulcsgének expressziós mintázata alapján feltételezett kemopreventív hatása alátámasztást nyert.

A két nem közt tapasztalt eltérő CoD™ tea szenzitivitást (melyet párhuzamos kísérletünkben, a túlélési idők vizsgálatában is megfigyeltünk) feltételezhetően az Uncaria tomentosa nonkompetitiv, koncentrációfüggő, ösztrogén inhibitor (ösztrogén receptror kötődés gátló hatású) és ezen kersztül a tamoxifenhez hasonló feltételezett paradox ösztrogén erősítő hatásán keresztül fejti ki [19].

 

1. Ember I, Kiss I and Pusztai Z: Effect of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene on onco/suppressor gene action in vivo: a short-term experiment. Anticancer Res. 18: 445-447, 1998.

2. Sándor J, Ambrus T and Ember I: [The function of the p53 gene suppressor in carcinogenesis.] Orv Hetil. 35: 1875-1883, 1995 [Article in Hungarian]

3. Gyöngyi Z, Grama L, Nádasi E, Sándor J, Németh A, Varga C, Kiss I and Ember I: Flow cytometric analysis of DMBA-induced early in vivo ras expression. In Vivo 16: 323-326, 2002.

4. Dickson RB, Salomon DS and Lippman ME: Tyrosine kinase receptor--nuclear protooncogene interactions in breast cancer. Cancer Treat Res. 61: 249-273. 1992.

5. Csontos Z, Nádasi E, Csejtey A, Illényi L, Kassai M, Lukács L, Kelemen D, Kvarda A, Zólyomi A, Horváth OP, Ember I. Oncogene and tumor suppressor gene expression changes in the peripheral blood leukocytes of patients with colorectal cancer. Tumori. 94(1): 79-82. 2008

6. Norton JD, Atherton GT. Coupling of cell growth control and apoptosis functions of Id proteins. Mol Cell Biol. (4): 2371-2381. 1998.

7. Smakman N, Borel Rinkes IH, Voest EE, Kranenburg O.: Control of colorectal metastasis formation by K-Ras. Biochim Biophys Acta. 1756(2): 103-114.  2005.

8. Orsós Zs, Nádasi E, Dávid T, Ember I, Kiss I. Effect of CoD tea consumption in a „short-term” test system on the expression of onco- and tumor suppressor genes. Egészségtudomány  50: 195-107. 2007.

9. Laus G., Brossner D., Keplinger K.: Alkaloids of Peruvian Uncaria tomentosa. Phytochemistry  45. 855-860.1997.

10. Keplinger K., Laus G., Wurm M., Dierich M.P., Teppner H.: Uncaria tomentosa (Willd.) DC. – Ethnomedicinal use and new pharmacological, toxicological and botanical results J Ethnopharmacol 64. 23-34. 1999.

11 de Santana CF, De Lima O, D'albuquerque IL, Lacerda AL, Martins DG: Antitumoral and toxicological properties of extracts of bark and various wood components of Pau d'arco (Tabebuia avellanedae). Rev Inst Antibiot 8. 89-94. 1968.

12. Ueda S., Umemura T., Dohguchi K., Matsuzaki T., Tokuda H., Nishino H., Iwashima A.: Production of anti-tumour-promoting furanonaphthoquinones in Tabebuia avellanedae cell cultures. Phytochemistry. 36. 323-325. 1994

13. Varga Cs, Ember I, Raposa T: Comparative studies on genotoxic and carcinogenic effects of different cytostatic protocols. I. In vivo cytogenetic analyses in CBA mice. Cancer Letters, 60: 199-203. 1991

14. Ember I, Varga Cs, Herceg L, Raposa T: Szekunder tumorok állatkísérletes modellje. In vivo citosztatikus kezelési protokollok karcinogén-leukemogén hatása. Magyar Onkológia, 46: 87-97. 1992

15. Budán F, Varjas T, Nowrasteh G, Varga Zs, Ember Á, Cseh J, Prantner I, Gombos K, Pázsit E, Gőbel Gy, Bauer M, Garacza T, Arany I, Perjési P, Ember I, Kiss I:

Early Modification of c-myc, Ha-ras and p53 Expressions by Chemical Carcinogens (DMBA, MNU) In Vivo (In press)

16. Ember Á., Budán F., Nowrasteh G., Varjas T., Gőbel Gy., Horváth Ö. P., Illényi L., Cseh J., Perjási P., Gergely P., Ember I., Kiss I.:  Molekuláris biomarkerek alkalmazása kolorektális karcinómás betegeken, a műtéti hatás monitorozása követéses vizsgálattal. Egészségtudomány (közlésre elfogadva)

17. Stowers SJ, Anderson MW. Formation and persistence of benzo(a)pyrene metabolite-DNA adducts. Environ Health Perspect. 62: 31-9. 1985

18. Kang HM, Jang JJ, Langford C, Shin SH, Park SY, Chung YJ. DNA copy number alterations and expression of relevant genes in mouse thymic lymphomas induced by gamma-irradiation and N-methyl-N-nitrosourea. Cancer Genet Cytogenet.166(1): 27-35. 2006

19. Salazar EL, Jayme V. Depletion of specific binding sites for estrogen receptor by Uncaria tomentosa. Proc West Pharmacol Soc. 41:123-124. 1998

 

^ oldal tetejére

VISSZA  A SZAKIRODALOMHOZ